空间转录组测序之实验相关 常见Q&A

随着高通量测序从2006年开始用于科研领域研究，对各物种的研究层面也从组织样本的基因/蛋白平均表达深入到单个细胞的基因/蛋白表达层面，再结合各种分子实验、体内外实验等验证进行更深入的机制研究。而就像体内外研究终归还是要落实到临床——验证临床实用性一样，如今空间转录组（Spatial transcriptomics，ST）测序对于空间层面的表达检测也是逐渐火热了起来。

 

如果我们将一个组织样本看作一个植物园，其内不同种类的植物比作不同类型的细胞，那普通转录组得到的就好比是收集起来的各种植物碎片，通过测序数据，我们可以知晓植物园内植物的整体颜色和香味，但我们无法具体获知来自于哪种植物；而单细胞转录组恰似从各种对应的植物里摘取一部分做成的插花，我们可以具体获知不同植物间的区别以及各自的特征；空间转录组描绘的则像是通过一个个二维照片，模拟出一个三维成像的植物园，不仅可以区分不同种类的植物，还能知晓植物在植物园中具体的位置。

 

 

图1 三种转录组测序数据（细胞比作植物）

 

由此看来，空间转录组测序为我们科研人员带来的是比单细胞转录组以及普通转录组测序更加贴近真实情况的数据，也难怪现今在我们基迪奥做空间转录组项目的客户越来越多了呢。今天，我们将收集到的一些关于老师们在空间转录组测序的实验过程中常遇到的疑惑进行答疑。

 

 

Q1：植物是否可以用于空间转录组？

 

 

理论上是可以的，植物也是可以通过mRNA的ploy A结构进行捕获。

 

但一般不推荐做成熟组织，因为性价比较低。主要有两个方面：

 

第一，成熟组织液泡大，使得单个检测spot内的细胞数量极低，基因表达活性也不是很高，不利于后续的数据呈现；

 

第二，成熟的植物，比如成熟的茎，会有大量的导管和筛管，前者基本上都是死细胞，后者基本上都没有细胞核，很少有基因表达。

 

图2 成熟植物组织

 

而新生组织的细胞密度以及数据质量相比下来会更高，所以如果做植物的空间转录组的话，更推荐使用新生组织样本。

 

 

Q2：Spot之间是否会发生交叉污染？弥散的交叉污染是可以怎么评估？

 

 

从目前的项目经验来看的话，在透化时间选取合适的情况下，捕获的mRNA是不会发生交串，也就不会发生spot之间交叉污染。这可以从两个方面来进行证明：

 

（1）在做组织优化时，我们可以通过荧光反转录可视化捕获序列对mRNA的捕获情况，如果发生弥散了的话，在这个时间点下做的透化一定会发生交叉污染；

（2）根据具有特异性的marker基因表达情况来进行评估，比如只在海马回表达的基因，如果在海马回周围组织也表达的话，就说明发生了交叉污染。

 

一个质量良好的样本是决定测序数据好坏的关键因素，不妨再看一下关于样本包埋方面的Q&A吧~

 

冰冻包埋

 

 

Q3：固定液只能使用甲醇吗？

 

 

目前是更加推荐使用甲醇固定，甲醇固定的原理是脱水，不会引起过多的化学反应。而像甲醛的话，固定原理是蛋白交联，可能会引起RNA和蛋白交联，影响后续RNA的释放，降低数据质量。

 

 

Q4：组织透化的最佳时间点如何确定？

 

 

可以使用组织优化芯片进行确定，按照梯度时间对组织进行透化，根据透化情况选择最佳时间点选择，标准如下：

 

1. 选择荧光信号最强的时间点；
2. 荧光信号差不多的情况下，选择弥散最小的时间点（说明mRNA没有发生交叉污染）；
3. 当荧光信号强度和弥散情况相同时，选择时间较长的时间点（保证尽量释放较多的mRNA）。

 

 

Tips

简单来说，宁愿选择不弥散的，即便数据会减少，但也好过发生mRNA交叉污染（数据有误）

 

图3 不同透化时间的两种样本切片

 

 

Q5：冷冻包埋方法如何选择？

 

 

现在的冷冻包埋方案主要有两种策略——先冷冻再包埋以及冷冻同时完成包埋

方法一：先冷冻后包埋

 

将组织在液氮降温的异戊醇中进行速冻，然后在干冰中完成OCT的凝固和组织包埋。

 

图4 液氮+异戊烷速冻

方法二：冷冻的同时完成包埋

 

将组织浸没在OCT中，放于干冰上，伴随着降温同步完成组织冷冻和包埋。

 

图5 干冰-OCT包埋前后

 

两种方法各有优劣，第一种方法可以快速降温，让组织快速度过冰晶期，保护细胞完整性，但是在包埋时接触相对高温的OCT可能造成组织边缘的细胞溶解；第二种方法组织不会形成二次冻融，切面的整体完整性更佳，但是，操作过程略复杂，在手术台或外出采样的情况下不易操作。

 

目前项目经验看下来，第二种干冰包埋法适合更多的组织类型，可以得到较好的切片结果。不过还是要根据组织类型来进行选择。如穿刺样本等一些较小、较轻的样本则一般推荐使用液氮+异戊烷的方法进行冷冻包埋。

 

不同组织类型的适应性也存在一定差异，因此最好还是做一下预实验，再根据预实验结果进行选择。

 

 

 

最近，随着10x官网推出石蜡包埋FFPE样本测序，基迪奥也是光速上线了FFPE空间转录组的产品项目，也看一看一些FFPE样本常见的相关答疑吧~

 

石蜡包埋

 

 

Q6：石蜡包埋块可以存放多久？

 

 

在包埋和保存的过程中会产生很多降解RNA的因素，例如甲醛固定、高温浸蜡、组织氧化等，因时间和存放条件的不同，RNA的降解速度也会存在不同。所以，仅依靠存放年限来判断石蜡包埋块是否可用是不准确的。目前是主要根据包埋块切片的RNA的DV200（片段长度大于200nt的RNA比例）指标来确定，达到50%就可以使用。

 

 

Q7：是什么物种都可以做FFPE切片来做空间转录组吗？

 

 

包括10x Visium技术以及DSP组学技术，现阶段都只适用于人和小鼠。数据是由探针来捕获，不同物种使用的探针体系不一样，因此其他物种都暂时不能使用。

 

 

Q8：与冷冻包埋相比，石蜡包埋的优势是什么？

 

 

第一点是研究针对性不同，石蜡包埋的样本可以保存较长时间，可以在后续对样本进行回顾性研究。而长期冻存组织的冰冻切片可能因冰晶的形成而破坏组织细胞形态的结构，造成抗原的弥散，定位不够准确。

 

第二点是可以弥补部分组织冷冻包埋效果不佳的弊端。如透化效果不佳或组织溶解性强就可以采用石蜡包埋。同时，石蜡切片可以切出较薄切片，原位杂交探针容易渗透到组织中去，得到数据颜色和形态都会较冰冻切片好。

 

这一期的Q&A就到此结束啦，不知道是否有解决老师们在空间转录组实验过程中遇到的疑惑呢？如果还有想深入了解的相关问题，不妨在公众号留言，下一期可能就会对此进行答疑哦~

 

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